Avances de la ciencia Antártica
El rol de las chaperonas de bacterias antárticas en la biosíntesis de nanopartículas de sulfuro de cadmio a bajas temperaturas
Los Quantum Dots (o puntos cuánticos) son nanopartículas que emiten luz bajo radiación ultravioleta con aplicaciones en electrónica, medicina y energía. Tradicionalmente se fabrican por métodos químicos, pero recientemente ha crecido el interés por producirlos de forma sustentable usando bacterias. El uso de estas para biosintetizar estos nanomateriales ofrece un proceso menos tóxico y más amigable con el medioambiente. Sin embargo, los mecanismos biológicos detrás de su formación aún no se comprenden del todo. En bacterias como Escherichia coli, se ha observado que compuestos como el glutatión y la cisteína, junto a proteínas que se unen a metales, estarían estabilizando las nanopartículas en formación. Además, se han reportado bacterias extremófilas que habitan ambientes muy salinos o ácidos, producen nanopartículas con algunas propiedades especiales, como una mayor estabilidad frente a condiciones extremas. En estudios previos, nuestro equipo identificó proteínas asociadas a puntos cuánticos de sulfuro de cadmio (CdS) en bacterias como E. coli, Halobacillus y Acidithiobacillus ferrooxidans. Destacan las chaperonas, proteínas que ayudan al correcto plegamiento y estabilidad de otras proteínas, especialmente bajo estrés celular, sugiriendo un papel clave en la formación de nanopartículas. Recientemente, trabajamos con Arthrobacter vasquezii, una bacteria antártica aislada cerca del glaciar Unión, que produce puntos cuánticos a bajas temperaturas (4 y 10 ºC). Su genoma muestra varias chaperonas (como DnaK, GroES, Hsp20 y GroEL), que podrían controlar el tamaño y estabilidad de las nanopartículas en frío. Aunque algunas chaperonas se han vinculado con nanopartículas químicas, se conoce poco sobre su papel en nanopartículas biológicas y en ambientes fríos. Nuestro objetivo es explorar cómo las chaperonas de Arthrobacter vasquezii contribuyen a esta biosíntesis a bajas temperaturas, para entender mecanismos moleculares desconocidos y fomentar métodos limpios y eficientes para fabricar nanomateriales con aplicaciones biotecnológicas.
Nicolás Bruna
Laboratorio de BioNanotecnología y Microbiología, Centro de Bioinformática y Biología Integrativa (CBIB), Universidad Andrés Bello
n.brunarivera@gmail.com
Los Quantum Dots (QD) son nanopartículas semiconductoras fluorescentes con tamaños entre 1 y 20 nanómetros de diámetro. Están formados por un núcleo inorgánico compuesto por elementos metálicos como cadmio, selenio, telurio, plata o azufre. Estas nanopartículas presentan propiedades ópticas y electrónicas muy particulares, producto del confinamiento cuántico, un fenómeno físico que restringe el movimiento de los electrones dentro de la partícula.
Gracias a esto, los QD pueden absorber luz ultravioleta (cercana a los 360 nm) y emitirla como fluorescencia en el espectro visible (entre 400 y 700 nm). El color de esa emisión depende del tamaño de la nanopartícula: cuanto más pequeñas son, más azul es la luz que emiten; a medida que el tamaño aumenta, la emisión se desplaza hacia el rojo (fig. 1).
La síntesis de QD se lleva a cabo principalmente por métodos químicos, sin embargo, también se han desarrollado métodos biológicos de síntesis de nanopartículas. En este enfoque, se utilizan bacterias como pequeñas “fábricas vivas” capaces de generar nanopartículas a partir de compuestos metálicos de forma más segura y sustentable. Si bien, a la fecha no se han determinado los mecanismos de biosíntesis de QD, nuestro grupo de investigación se ha centrado en comprender cómo ocurre el fenómeno de biosíntesis en bacterias a bajas temperaturas.
En nuestro laboratorio desarrollamos un método para producir Quantum Dots de sulfuro de cadmio (CdS) utilizando bacterias. Para ello, trabajamos con una cepa llamada Arthrobacter vasquezii, aislada de suelos antárticos en los montes Ellsworth (glaciar Unión).
Gracias a esta bacteria fue posible obtener QD a solo 4 grados, una temperatura extremadamente baja para este tipo de procesos. Luego de purificar las nanopartículas, identificamos un conjunto de 32 proteínas que probablemente forman una especie de “caparazón” biológico que las recubre y estabiliza. Entre estas proteínas, una de las más destacadas fue la chaperona DnaK, conocida por ayudar a otras proteínas a plegarse correctamente, especialmente bajo condiciones de estrés como el frío extremo.
Para confirmar el papel que cumple esta proteína, trabajamos con distintas cepas de Escherichia coli modificadas: una sin el gen dnaK y otra que lo sobreexpresaba. Las bacterias sin el gen dnaK generó QD de CdS más lentamente y mostró una fluorescencia más débil en relación a la cepa que sobreexpresaba la proteína DnaK, la cual generó nanopartículas con mayor intensidad de fluorescencia, lo que es un indicativo de una síntesis más eficiente (fig. 2).
Luego, purificamos la proteína DnaK y la añadimos directamente a ensayos biológicos y químicos de síntesis de QD. En los ensayos biológicos, donde las bacterias sintetizaban las nanopartículas, vimos que al agregar DnaK se aceleraba la formación de QD y aumentaba su emisión de fluorescencia (fig. 3). Enseguida, probamos un enfoque biomimético: un sistema sin bacterias, solo con los compuestos necesarios y la proteína purificada. En estos ensayos también observamos que mayores concentraciones de la proteína DnaK purificada aumentaba la intensidad de fluorescencia, tanto con la proteína obtenida de E. coli como con la de Arthrobacter vasquezii. Esta última fue especialmente efectiva, incrementando la fluorescencia hasta cuatro veces más que el control sin proteína (fig. 4).
Estos hallazgos son consistentes con lo observado en los ensayos biológicos y muestran que la presencia de DnaK favorece la nucleación y aumenta la cantidad de nanopartículas formadas, especialmente cuando se utiliza la variante proveniente de la bacteria antártica Arthrobacter vasquezii.
En conjunto, nuestros resultados indican que las chaperonas, particularmente DnaK, cumplen un papel central en la formación y estabilidad de los Quantum Dots incluso a bajas temperaturas. Las proteínas provenientes de microorganismos antárticos podrían transformarse en herramientas valiosas para desarrollar métodos biotecnológicos más limpios y eficientes para la producción de nanomateriales con diversas aplicaciones.
Figuras
Figura 1. Quantum Dots (QD) de distintos tamaños y sus colores de emisión fluorescente. El color varía del azul al rojo a medida que aumenta el tamaño de las nanopartículas. (Figura obtenida de Petryayeva et al., 2013).
Petryayeva, E., Algar, W. R., & Medintz, I. L. (2013). Quantum dots in bioanalysis: a review of applications across various platforms for fluorescence spectroscopy and imaging. Applied spectroscopy, 67(3), 215-252.
Figura 2. Biosíntesis de nanopartículas de CdS mediada por E. coli con diferente expresión de la chaperona DnaK.
(A) Biosíntesis de nanopartículas de CdS a 37 grados utilizando E. coli BW25113 (WT) y una cepa mutante por deleción del gen dnaK (E. coli ΔdnaK). Las muestras fueron incubadas por distintos tiempos (0,5 – 2 h) y expuestas a luz UV (excitación a 360 nm). (B) Biosíntesis de nanopartículas de CdS utilizando E. coli AG1 transformada con el plásmido vacío pCA24N y con pCA24N-dnaK, que sobreexpresa la chaperona DnaK.
Figura 3. Biosíntesis de Quantum Dots de CdS en presencia de la chaperona DnaK purificada.
(A) Exposición a luz UV de Quantum Dots de CdS biosintetizados por E. coli BW25113 en presencia de concentraciones crecientes de la proteína DnaK purificada desde E. coli (10, 20, 50, 100 y 200 µg/mL). Se incluyeron un control positivo (sin adición de DnaK). (B) Exposición a luz UV de Quantum Dots de CdS biosintetizados en presencia de concentraciones crecientes de la proteína DnaK purificada desde Arthrobacter vasquezii expresada heterólogamente en E. coli (10, 20, 50, 100 y 200 µg/mL).
Figura 4. Síntesis biomimética de QD de CdS en presencia de la proteína DnaK purificada de E. coli y Arthrobacter vasquezii. (A) Síntesis de QD de CdS a 37 ºC. La imagen muestra tubos con QD de CdS expuestos a luz UV en presencia de 50 y 100 µg/mL de la proteína DnaK de E. coli. (B) Espectros de emisión de fluorescencia de QD de CdS sintetizados a 37 ºC. Los espectros corresponden a muestras con 50 y 100 µg/mL de la proteína DnaK de E. coli. (C) Síntesis de QD de CdS a 37 ºC. La imagen muestra tubos con QD de CdS expuestos a luz UV en presencia de 50 y 100 µg/mL de la proteína DnaK de Arthrobacter sp. (D) Espectros de emisión de fluorescencia de QD de CdS sintetizados a 37 ºC. Los espectros corresponden a muestras con 50 y 100 µg/mL de la proteína DnaK de Arthrobacter vasquezii.